李斯特菌(也稱李氏桿菌)引起的急性傳染病,以敗血病為主要癥狀,伴有內(nèi)臟器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。李斯特菌是1926年英國南非裔科學(xué)家穆里在病死的兔子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的,為紀(jì)念近代消毒手術(shù)之父、英國生理學(xué)家約瑟夫·李斯特(1827~1912),1940年被第三屆微生物學(xué)大會(huì)命名為李斯特菌。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病,感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中,食品中存在的單增李氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn),該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一,因此,在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中,必須加以重視。
李斯特菌在環(huán)境中無處不在,在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染,很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌,并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
其中單增李斯特菌是*能引起人類疾病的。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病,感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 增菌培養(yǎng)
將未開封的測試片貯藏在≤8℃的環(huán)境下,并在包裝上標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。在高濕度的地方,在使用前將測試片回復(fù)到室溫。
取回的樣品應(yīng)在4℃下處理、存放和運(yùn)送,如果是冷凍樣品,則在檢驗(yàn)前要保持冷凍狀態(tài)。
取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯(EB)的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì),然后轉(zhuǎn)入三角瓶中,30℃培養(yǎng)4h,加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮,繼續(xù)培養(yǎng)20h和44h.。
2. 分離
共培養(yǎng)24h和48h后,取EB培養(yǎng)物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3 LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養(yǎng)24-48h,LPM平板在30℃培養(yǎng)24-48h。然后,把LPM平板放于解剖鏡載物臺(tái)上,以450角入射光從平板下面照射平板,通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對(duì)照。
3. 鑒定步驟
為防止暴露于潮濕的環(huán)境中,請(qǐng)不要冷藏已開封的測試片。將膠帶封好的測試片貯藏在低溫干燥的地方,保持時(shí)間不超過1個(gè)月。請(qǐng)勿將測試片放在溫度> 25℃和(或)相對(duì)濕度>50%的環(huán)境中。
1)觀察TSAYE平板通過斜射光觀察,尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對(duì)照。
2)從30℃或更低溫度下培養(yǎng)的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少,菌體黏附于載玻片上而呈現(xiàn)非運(yùn)動(dòng)性。李斯特氏菌是細(xì)短桿菌,可見輕微的旋轉(zhuǎn)及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對(duì)照相比,球形、大的桿狀且快速泳動(dòng)的都不是李斯特氏菌。
3)挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn),李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應(yīng)。
4)取16-24h的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色,李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培養(yǎng)物革蘭氏染色會(huì)發(fā)生變化,而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢(shì),易誤認(rèn)為白喉菌而錯(cuò)判。
4. 用涂抹棒、海棉或其它采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。濕潤采樣設(shè)備的液體應(yīng)≤10 mL。濕潤劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW),或中和緩沖液,如Letheen肉湯或Dey/Engley (DE)中和肉湯。
5)挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中,35℃培養(yǎng)24h用做糖類發(fā)酵和其它生化項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天,也可反復(fù)接種。
6)在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上,刺種時(shí)避免觸到平板底部和使瓊脂破裂,同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌)和陰性對(duì)照(英諾克李斯特氏菌),35℃培養(yǎng)48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環(huán)。
7)在明亮的光照下,觀察經(jīng)穿刺的血瓊脂平板,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清晰的β-溶血環(huán),英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象,而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限明顯的較大溶血環(huán),在此不要試圖進(jìn)行種間的區(qū)分,但要記錄下溶血反應(yīng)的特征,CAMP試驗(yàn)可區(qū)分它們間的溶血反應(yīng)。
8)硝酸鹽還原試驗(yàn)(選做)。用TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中,35℃培養(yǎng)5天后,加入0.2mL試劑A,再加入0.2mL試劑B,混合,出現(xiàn)紫紅色為陽性反應(yīng),表明硝酸鹽已被還原,如無顏色出現(xiàn),在試管內(nèi)再加入少量鋅粉,放置1h,如出現(xiàn)紫紅色,表明硝酸鹽仍存在,未被細(xì)菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽,因此,從格氏李斯特氏菌中區(qū)分出默氏李斯特氏菌就必須進(jìn)行這*的試驗(yàn)。本試驗(yàn)還有一等效試驗(yàn),即加入0.2mL試劑A后,再加入0.2mL試劑C,出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現(xiàn)顏色反應(yīng),也加入少量鋅粉,若出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽未被還原。
5. 在無菌環(huán)境下在收集的樣品中添加5 mL,20-30℃,滅過菌的緩沖蛋白胨水(BPW)溶液。不要將Petrifilm EL測試片與Vermont 培養(yǎng)基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養(yǎng)基 (LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養(yǎng)基(BLEB)共用。
9)將TSBYE培養(yǎng)物穿刺到SIM和MTM試管中,室溫培養(yǎng)7天,每日觀察,李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時(shí),30℃的TSBYE培養(yǎng)物在油鏡下可見細(xì)菌作翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
10)將TSAYE肉湯培養(yǎng)物分別接種于0.5%(W/V)葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)(可選用倒立發(fā)酵管),35℃培養(yǎng)7天,呈陽性反應(yīng)的李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,李斯特氏菌發(fā)酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對(duì)葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發(fā)酵,除格氏李斯特氏菌均不能發(fā)酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3 的LPM分離平板上菌落色素很明顯,則七葉苷試驗(yàn)可免做。
6. 混合,蠕動(dòng)或旋轉(zhuǎn)樣品與BPW的混合液將近一分鐘。將樣品置于室溫(20-30℃) 1h,zui久不超過1.5 h,以修復(fù)損傷的李斯特菌。
將TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種到3mLTSBYE肉湯中,35℃培養(yǎng)24h,接種2支TSAYE瓊脂斜面,35℃培養(yǎng)24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下,菌懸液于80℃水浴中加熱1h,以2500r/min離心30,棄去2mL上清夜,將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液,進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)。
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