黑色素瘤細(xì)胞株在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細(xì)胞株能繼續(xù)生長,同時也將細(xì)胞株數(shù)量擴大,就必須進(jìn)行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞株種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞株進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型黑色素瘤細(xì)胞株直接分瓶就可以,而貼壁細(xì)胞株需經(jīng)消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶(比如胰蛋白酶)消化貼壁細(xì)胞株成單個細(xì)胞株,也可加入乙二胺四乙酸(EDTA)提高消化能力,EDTA 是一種二價離子的螯合劑,能抑制黑色素瘤細(xì)胞株膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細(xì)胞株消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA,一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置,先用胰酶-EDTA 消化液清洗細(xì)胞株(5.0 -10.0 ml/75cm),然后棄去消化液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask) ,觀察細(xì)胞株直到細(xì)胞株變圓脫離瓶壁,此過程一般需要5-15分鐘,為了避免細(xì)胞株成團(tuán),消化黑色素瘤細(xì)胞株的過程中不要拍打細(xì)胞株瓶。對于特別難消化的細(xì)胞株,可以加入胰酶EDTA 消化液后把細(xì)胞株置于37°C 促進(jìn)消化,細(xì)胞株脫離瓶壁后,立刻加入含有血清的*培養(yǎng)基中止消化,血清中某些蛋白質(zhì)能夠抑制胰酶的活性。一般情況下,離心并不需要。如果
黑色素瘤細(xì)胞株需要無血清或者低血清的培養(yǎng)基,可以以125000g 轉(zhuǎn)速離心5分鐘,然后棄去中止用的培養(yǎng)基,加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細(xì)胞株,移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細(xì)胞株類型而定,一般是1:2-1:20,具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細(xì)胞株的黑色素瘤細(xì)胞株膜產(chǎn)生損傷,對于這種類型的細(xì)胞株,可用細(xì)胞株刮輕輕刮下細(xì)胞株,加入適量的培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻細(xì)胞株,然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣,考慮到培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞株因傳代而遲早會出現(xiàn)變異,有時因寄贈、交換和購買,培養(yǎng)細(xì)胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室,*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊黑色素瘤細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?,F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時,細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止,即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài),故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵,在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi),水晶呈針狀,極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
傳代黑色素瘤細(xì)胞株可提供復(fù)蘇,凍存細(xì)胞,ATCC細(xì)胞。具體可根據(jù)科研人員要求決定。代做各種細(xì)胞服務(wù)。
對于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸(倒)盡培養(yǎng)基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱(或PBS洗1-3次)。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml,按此比例進(jìn)行消化,晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘,鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后,輕輕振動瓶底使細(xì)胞全部脫落,加入2-3ml*培養(yǎng)基后,輕輕吹打,使
黑色素瘤細(xì)胞株基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養(yǎng)瓶內(nèi),加入*培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒灐?/div>